P1 Transdüksiyon Yöntemi ile Birden Fazla Gen Bakımından Mutant Olan Escherichia coli Suşlarının Elde Edilmesi

Abstract

Bakterilerde gen fonksiyonlarının keşfedilmesi ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi için mutant suşların oluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla gen açısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdır çünkü bazı spesifik aktiviteler birden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlü veya çoklu mutantların oluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bu faj, gelişimi sırasında, E. coli kromozomunun parçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgele bir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcı bakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleri arasındaki benzerlik ve seçici bir belirteç yardımıyla, transdüktanlar’ın elde edilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülan bir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegre olamamaktadır. Fajın bu özelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerden birisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır. Rekombinasyon teknolojisinde kullanılan bu teknik, E. coli genomuna ait DNA parçalarının, farklı suşlar arasında taşınmasını sağlamaktadır. Bu çalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akış ve yeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulması amaçlanmıştır. Bunun için, KEIO koleksiyonundan elde edilen dört adet tekli gen mutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı bir alıcı suş oluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. KanR kasetlerine sahip diğer dört adet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarak kullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar elde edilmiştir. Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fajların içerdikleri DNA parçalarını, alıcı suş genomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabii tutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutant suşlar olan ikili mutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri tsgAugpA, yhdTompA, ugpAmdtG ve aroGmalF olan, dört adet ikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlara ait detaylar sunulmuş ve tartışılmıştır.